Då vårt PAX-erbjudande fortsätter att växa, vill vi gärna hjälpa dig med en FAQ om PAX för att du ska få ut det mesta av vår nya metod för allergentestning.

Vad är molekylär allergologi?

Molekylär allergologi är en toppmodern metod för påvisande av sensibilisering, där definierade enskilda allergenkomponenter används för att mäta specifikt IgE, istället för traditionella allergenextrakt. De molekylära komponenterna är renade eller rekombinanta proteiner som ger en högre standardisering än allergenextrakt och möjliggör en mer exakt identifiering av IgE-medierade sensibiliseringar. Under det senaste decenniet har molekylära allergentester för människor använts framgångsrikt för att hitta de symtomutlösande allergenerna och utgöra en bra grund för val av terapi.

Vad är PAX?

PAX (Pet Allergy Xplorer) är den första kommersiella veterinära multiplexmakroarray-kvantitativa IgE-serologiska analysen. Testet körs på kassetter med mellan 250 och 300 allergener. Både extrakt (en tredjedel) och molekylära komponenter (individuella allergener, två tredjedelar) testas.

Hur valdes allergenerna för PAX ut?

PAX är en veterinär version av ALEX2, som används till test av människor. Först eliminerade vi alla extrakt och komponenter (dvs. molekylära allergener) som ansågs vara irrelevanta för djur (till exempel kiwi, räkor, persika, etc.). Eftersom ALEX2 innehåller få extrakt la vi till de som tidigare visat sig vara viktiga för hundar, såsom Dermatophagoides farinae (husdammskvalster) och Tyrophagus putrescentiae (förrådskvalster).

Eftersom det finns unika egenskaper som gör ett protein till ett allergen behöll vi alla komponenter från ALEX2 som sannolikt även djur-IgE binder till. Slutligen lade vi till alla komponenter som är kända allergener för djur och som saknades i ALEX2. Efter att ha testat över 1 000 hundsera från Europa såg vi att nästan alla extrakt och komponenter hade gett positiva resultat för specifik IgE-detektion hos en varierande andel hundar, vilket bekräftar att tillvägagångssättet för val av allergener var riktigt. Nextmune kommer att justera vilka extrakt och komponenter som finns på kassetten över tid så att allergener som sällan eller aldrig blir positiva kommer att tas bort. Samtidigt kommer forskare på Nextmune att arbeta med att karakterisera allergomet (databas med allergena molekyler) hos hundar, katter och hästar så att viktiga nya komponenter regelbundet kan läggas till på kassetterna.

Kan ikteriska, lipemiska och hemolyserade prover analyseras?

Ett serumprov från hund innehållande allergenspecifikt IgE vid olika koncentrationer tillsattes extra bilirubin (2,5 mg/dl), triglycerider (150 mg/dl) eller hemoglobin (15 g/dl) i. Alla specifika IgE-värden låg inom 25% av värdena för serum utan tillsats och det genomsnittliga förhållandet för serumet med extra tillsats jämfört med det utan tillsats varierade mellan 96 och 100%. Slutsats: det finns ingen relevant påverkan av ikterus, lipemi eller hemolys på resultaten av PAX för hund.

PAX för häst har däremot visat sig vara känslig för hemolys.

Vad är CCDs och var återfinns de?

De flesta allergener är glykoproteiner, vilket innebär att vissa aminosyror har en kolhydrat-(socker)kedja. Allergener från växter (inklusive växtbaserade livsmedel), insekts- (bi)gifter och nematoder (maskar) har kolhydratkedjor som skiljer sig från de hos däggdjur. Som ett resultat kan dessa kedjor känns igen av IgE från människor och djur. Eftersom kolhydratkedjorna är likadana hos många allergener, kan de utlösa korsreaktioner, varför de kallas CCDs, eller korsreaktiva kolhydratdeterminanter.

Hur är CCDs involverade i allergi?

Studier har visat att CCDs förekommer hos 30% av alla människor, hundar och katter. Vid en allergisk reaktion produceras hos dessa individer IgE mot kolhydratkedjor utöver IgE mot allergenproteiner. IgE mot CCD-kedjor verkar inte vara kliniskt relevant.

Varför är det viktigt att blockera CCD?

Blockering av CCD innebär att specificiteten hos det serologiska testet förbättras. Det finns belägg för att korrelationen med intradermala testresultat också förbättras.

Blockeras korsreaktiva kolhydratdeterminanter (CCD) i PAX?

Ja, när CCDs påvisats tillsätts ett blockeringsämne. PAX är det första veterinärmedicinska serologiska testet som dessutom har CCD-detektorer på varje kassett för att kontrollera att CCD-blockeringen varit effektiv. Om CCDs inte blockerats fullständigt upprepas blockeringen varpå ännu en kontroll görs.

Vilket anti-IgE-reagens används i PAX?

För hundtestet använder PAX den monoklonala antikroppen 5.91 mot IgE från hund, som togs fram under 1990-talet av professor Bruce Hammerberg vid NC State University College of Veterinary Medicine. Denna antikropp känner igen en epitop i Ce2-segmentet av Fc-fragmentet av IgE från hund. Epitopen skiljer sig från de IgE-regioner som binder till hög- och lågaffinitets-IgE-receptorer, vilket säkerställer att det inte förekommer någon interferens från de fria IgE-receptorer som finns naturligt hos allergiska hundar. Av betydelse är att sekvensen för den epitop som känns igen på hund-IgE är helt annorlunda än den som finns på hund-IgM, IgA och de fyra olika IgG-underklasserna (IgG1 till IgG4). Vi har med hjälp av både standard-ELISA och PAX verifierat att antikroppen 5.91 inte binder till IgG från hundar.
Tillförlitliga antikroppar mot ekvint IgE har också identifierats och inkluderats i PAX för häst. 

Vilken är analysens precision?

Precisionen fastställdes under två olika förhållanden:
För kassetternas batch-variation jämfördes två olika partier med 54 allergenkombinationer som täckte in 44 allergener. För specifika IgE-värden lägre än 400 ng/ml var variationskoefficienten (CV) inom analysen 3,0% och CV mellan analyserna 7,1%. För värden över 400 ng/ml var CV 2,0% respektive 5,2%.
För bestämning av reproducerbarheten testades tre serumprover från hund i duplikat i fem olika körningar. Som ovan, för de lägre IgE-värdena, CV 6,2% respektive 8,2%; för de högre värdena var de 2,7% respektive 7,0%.
Slutsats: Precisionen hos PAX är utmärkt och testet har hög reproducerbarhet.

Varför är det fler negativa resultat när jag skickat hundsera som testats med PAX jämfört med äldre tekniker?

För att svara korrekt på denna fråga, låt oss titta på de PAX-resultat som hittills samlats in under 2023 från över 25 000 hundar.

I Europa (11 196 sera) var andelen hundar med åtminstone ett positivt resultat varierande beroende på testlaboratorium (Spanien, Nederländerna och Storbritannien) och månaden för testningen, mellan 83% (Spanien, april) och 96% (Storbritannien, juni). Om man endast skulle överväga andelen hundar som skulle vara kandidater för immunterapi (det vill säga, exklusive foderallergener, insektsgifter och loppans salivallergen Cte f 1), skulle procentandelarna variera mellan 51% (Storbritannien, april) och 88% (Storbritannien, juni; Nederländerna, april).

I USA har andelen hos 14 243 hundar med åtminstone en påvisbar specifik IgE med PAX förblivit ganska stabil under större delen av vintern och våren (84-87%) för att öka i juli (88%) och augusti (95%). Bland dessa varierade andelen hundar som potentiellt kunde behandlas med immunterapi från en låg nivå på 70% i januari, successivt ökande varje månad för att nå 91% i augusti.

Även om vissa veterinärer ibland kan få en serie negativa tester, är detta inte en allmän situation, eftersom siffrorna ovan ligger väl inom det intervall som skulle förväntas enligt litteraturen. Man måste komma ihåg att vissa hundar har kliande tillstånd som liknar atopisk dermatit (AD) men som ändå inte är allergiska, medan andra har AD med en lesionsmekanism som troligtvis inte involverar IgE. I själva verket representerade så kallad "atopi-liknande dermatit" ungefär 15% av hundar med en fördelning av lesioner och klåda som är typisk för AD, men negativa intradermala och serologiska tester i en nyligen studie (Botoni, Vet Dermatol 2019).

Varför finns det en sådan variation?

Svaret är enkelt: dessa skillnader beror på varierande exponering för säsongsmässiga pollen. Låt oss titta på USA, för vilket vi har PAX-data sedan januari 2023. På vintern låg seropositivitetsgraden för åtminstone ett pollen runt 40%. Denna grad varierade mellan 48 och 64% på våren, och på sommaren steg den till 86% i augusti. På samma sätt fanns det en stadig ökning av antalet allergener som kunde ingå i immunoterapi: cirka 4 på vintern, 5 på våren och 10 i augusti.

I Europa har vi haft identiska variationer i positiva resultat för pollenallergener. Till exempel var seropositivitetsgraden för Fag s 1, PR-10 allergenet från Fagus sylvatica (vanlig bok), 57% i mars, 45% i april, för att sedan sjunka till cirka 10-15%. I motsats till detta, och på grund av en senare pollineringstid, var toppen av sensibilisering för Fag s 1 i Storbritannien i maj för att sedan sjunka långsamt. På samma sätt och som förväntat var sensibiliseringen för gräspollen högst i juli i laboratorierna i Nederländerna och Storbritannien. Inte bara måste vi tänka på pollineringssäsongen, utan meteorologiska faktorer tros också påverka frisläppandet av pollen. Ett utmärkt exempel är det som observerades i det spanska PAX-laboratoriet, som huvudsakligen testar serum från hundar som bor i medelhavsländer och Frankrike. Den här sommaren har nivån av IgE-seropositivitet för gräs- och ogräspollen varit betydligt lägre än vad som förväntades, troligtvis på grund av värmeböljan som drabbade den delen av Europa i juli och augusti.

Varför observerades sådana fluktuationer inte tidigare?

Det verkar finnas bara en studie (Bjelland, Acta Vet Scand 2014) som dokumenterade en sådan variation. Hos norska hundar som testats med Heskas Allercept-test var graden av seropositivitet för allergener högre på sommaren och hösten (cirka 87%) än på vintern och våren (79%). Säsongsvariationen var större för pollenallergener, med en låg sensibiliseringsgrad på 39% på vintern och 50% på sommaren.

Det finns vissa serologiska tester där denna säsongsvariation kanske inte är uppenbar. Den huvudsakliga förklaringen till detta ligger troligtvis i otillräcklig blockering av IgE som känner igen plantallergenbundna korsreaktiva kolhydrater (dvs. "CCD-IgE"), vilket leder till felaktiga positiva testresultat. Medan de flesta laboratorier nu inkluderar CCD-IgE-blockeringssteg, är Nextmunes PAX den enda som detekterar effektiviteten av en sådan blockering. Om den första blockeringen anses otillräcklig genomförs en andra blockering, vilket kan resultera i en fullständig negativ reaktivitet gentemot pollensextrakt. Dessutom är nästan alla pollenallergenkomponenter i PAX rekombinanta proteiner som saknar CCD.

För att sammanfatta är positivitetsgraden för PAX liknande den för andra tidigare rapporterade testresultat, men det finns en stark påverkan av testningssäsongen på den totala sensibiliseringsgraden och på den för pollen. Dessutom eliminerar en unik CCD-blockeringsstrategi troligtvis CCD-IgE, vilket kan leda till felaktig positiv IgE-reaktivitet mot pollen och växtmatallergener i andra serologiska tester.

Vad kan göras för att begränsa negativa PAX-resultat?

Här är vår rekommenderade strategi:

1. Skicka serum ungefär en månad efter början av säsongen då hunden är känd för att uppvisa symtom och
2. Testa när hunden är mitt i en symtomperiod så att T-cellerna hinner aktivera IgE-sekretionen av B-cellerna.

Slutligen, kom ihåg att du kan ha hundar med atopi-liknande dermatit där hud- och serumkänslighetstester kommer att vara negativa.