Terwijl ons PAX-propositie blijft groeien, zijn we u graag verder van dienst te met een FAQ over PAX. Op deze manier haalt u het maximale uit onze nieuwe methode voor allergietesten.

Wat is moleculaire allergologie? 

Moleculaire allergologie is een geavanceerde benadering voor de detectie van sensitisaties, waarbij gedefinieerde losse allergeencomponenten worden gebruikt voor de bepaling van specifieke IgE in plaats van traditioneel gebruikte allergeenextracten. De moleculaire componenten zijn gezuiverde of recombinante eiwitten die een hoger niveau van standaardisatie bieden dan allergeenextracten en een nauwkeurigere identificatie van IgE-sensitisaties mogelijk maken. In het afgelopen decennium zijn moleculaire allergologietesten voor mensen krachtige hulpmiddelen geweest om allergietriggers te vast te stellen, wat risicobeoordeling en therapiebeslissingen vergemakkelijkt.

Wat is PAX?

De PAX (Pet Allergy Xplorer) is de eerste commerciële veterinaire multiplex-macroarray kwantitatieve IgE-serologische test. De test gaat uit van cartridges met tussen de 250 en 300 plekken met zowel extracten (een derde) als moleculaire componenten (bijvoorbeeld individuele allergenen, twee derde).

Hoe zijn allergenen geselecteerd voor PAX?

PAX is afgeleid van de ALEX2 die voor mensen wordt gebruikt. We hebben eerst alle extracten en componenten (de moleculaire allergenen) geëlimineerd die als irrelevant voor huisdieren werden beschouwd (bijvoorbeeld die van kiwi, garnalen, perzik, enz.). Omdat de ALEX2 weinig extracten bevat, hebben we vervolgens de extracten toegevoegd waarvan we weten dat ze belangrijk zijn voor honden, zoals die voor de huisstofmijt Dermatophagoides farinae en de opslagmijt Tyrophagus putrescentiae. 

Aangezien er unieke kenmerken zijn die een eiwit tot een allergeen maken, hebben we vervolgens alle componenten uit de ALEX2 gehouden die waarschijnlijk zouden worden aangevallen door dierlijk IgE.

Tenslotte hebben we alle componenten toegevoegd die bekend staan als allergenen voor dieren en afwezig waren in de ALEX2 voor mensen. Na het testen van meer dan 1000 hondenserums uit Europa konden we zien dat bijna alle extracten en componenten positieve specifieke IgE-detectie hadden opgeleverd bij een variërend percentage van honden, wat de benadering voor allergeenselectie bevestigde. Nextmune zal de aard van de extracten en componenten op de cartridge in de loop van de tijd aanpassen, zodat allergenen die niet of slecht reactief zijn zullen worden verwijderd. Aan de andere kant zullen wetenschappers van Nextmune werken aan het karakteriseren van het "allergoom" van honden, katten en paarden, zodat belangrijke nieuwe componenten regelmatig aan de cartridges worden toegevoegd.

Is er interferentie van icterus, lipemie en hemolyse?

Een serummonster dat allergeenspecifiek IgE bevatte in verschillende concentraties, werd aangevuld met bilirubine, triglyceriden of hemoglobine op concentraties van respectievelijk 2,5, 150 en 15 mg/dL. Alle specifieke IgE-waarden lagen binnen 25% van die van het serum zonder toevoeging, en het gemiddelde ratio van het gemanipuleerde serum ten opzichte van het serum zonder toevoeging varieerde tussen 96 en 100%. Kortom: er is geen relevante invloed van icterus, lipemie of hemolyse op de PAX-resultaten.

Wat zijn CCD's en waar worden ze gevonden?

De meeste allergenen zijn glycoproteïnen, wat betekent dat sommige aminozuren een koolhydraat(suiker)-keten hebben. De allergenen van planten (inclusief plantaardig voedsel), insecten (bijen) en nematoden (wormen) hebben koolhydraatketens die verschillend zijn van die van zoogdieren. Hierdoor kunnen deze ketens worden herkend door IgE van zowel mensen als dieren. Helaas kunnen, omdat de suikers worden gedeeld tussen allergenen, kruisreacties optreden, vandaar dat ze CCD's worden genoemd, of kruisreactieve koolhydraatdeterminanten.

Hoe zijn CCD's betrokken bij allergie?

Tijdens een allergische reactie wordt IgE geproduceerd tegen zowel de koolhydraatketens als de eiwitten van het allergeen. Studies hebben bevestigd dat dit voorkomt bij 30% van de mensen, honden en katten. Het IgE tegen CCD-ketens lijkt niet klinisch relevant te zijn.

Waarom is het belangrijk om CCD's te blokkeren?

Het blokkeren van CCD's betekent dat de specificiteit van de serologische test wordt verbeterd. Bewijs toont aan dat de correlatie met intradermale testresultaten ook wordt verbeterd.

Worden kruisreactieve koolhydraatbepalers (CCD) in PAX geblokkeerd?

Elk dierlijk serum dat wordt getest, wordt verdund in een buffer die een eigen mix van eiwitten bevat die verschillende soorten CCD's bevatten. PAX is ook de eerste veterinaire serologische test die CCD-detectoren op elke cartridge heeft geïntegreerd om de efficiëntie van de CCD-blokkering te verifiëren. 

Welke anti-IgE-reagens wordt gebruikt in de PAX?

Voor de hondentest gebruikt de PAX het anti-hond IgE monoklonaal 5.91, dat in de jaren 1990 is geproduceerd door Prof. Bruce Hammerberg aan het College of Veterinary Medicine van de North Carolina State University. Dit antilichaam herkent een epitoop in het Ce2-segment van het Fc-fragment van hond IgE. Het epitoop verschilt van de IgE-regio's die binden aan de hoog- en laag-affiniteit IgE-receptoren, waardoor er geen interferentie is van de oplosbare IgE-receptoren die van nature aanwezig zijn bij allergische honden. Belangrijk is dat de sequentie van het epitoop dat wordt herkend op hond IgE volledig verschilt van dat aanwezig op hond IgM, IgA en de vier verschillende IgG-subklassen (IgG1 tot IgG4). In feite hebben we, met behulp van zowel de standaard ELISA als de PAX, geverifieerd dat het 5.91-antilichaam niet bindt aan IgG van honden.
Conclusie: het monoklonale anti-IgE 5.91 is uniek specifiek voor IgE van honden. Voor katten en paarden zal een ander antilichaam worden gebruikt. De precisie van de PAX is uitstekend, met zeer reproduceerbare resultaten.

Wat is de precisie van de test?

De precisie werd bepaald onder twee verschillende omstandigheden. Voor de variatie tussen de batches van cartridges werden twee verschillende partijen vergeleken met behulp van 54 combinaties van allergenen/monsters die 44 allergenen beslaan. Voor specifieke IgE-waarden lager dan 400 ng/mL was de intra-assay variatiecoëfficiënt 3,0% en de inter-assay variatiecoëfficiënt was 7,1%. Voor waarden boven de 400 ng/mL waren deze variatiecoëfficiënten respectievelijk 2,0% en 5,2%.
Voor de bepaling van de herhaalbaarheid werden drie monsters van hondenserum in duplicaat getest in vijf verschillende runs. Zoals hierboven, waren de intra- en inter-assay variatiecoëfficiënten voor lagere IgE-waarden 6,2% en 8,2% respectievelijk; die voor hogere waarden waren respectievelijk 2,7% en 7,0%.
Conclusie: De precisie van de PAX is uitstekend, met zeer reproduceerbare resultaten.

Waarom zijn er meer negatieve resultaten wanneer ik hondenserum stuur dat getest is met de PAX in vergelijking met oudere technologieën?

Om deze vraag beter te beantwoorden, kijken we naar de PAX-resultaten die tot nu toe in 2023 zijn verzameld van meer dan 25.000 honden.
In Europa (11.196 sera) varieerde het percentage honden met op zijn minst één positieve reactie afhankelijk van het testlaboratorium (Spanje, Nederland en het VK) en de testmaand, tussen 83% (Spanje, april) en 96% (VK, juni). Als we alleen zouden kijken naar het percentage honden dat in aanmerking komt voor immunotherapie (dat wil zeggen, exclusief voedselallergenen, insectengif en vlooienallergeen Cte f 1), dan zouden de percentages variëren tussen 51% (VK, april) en 88% (VK, juni; NL, april).

In de VS is het percentage van 14.243 honden met op zijn minst één detecteerbare specifieke IgE met de PAX vrij stabiel gebleven gedurende de winter en lente (84-87%), om in juli (88%) en augustus (95%) te stijgen. Onder deze honden varieerde het percentage dat mogelijk behandeld kan worden met immunotherapie van 70% in januari, met een stijging elke maand tot 91% in augustus.

Hoewel sommige dierenartsen af en toe een reeks negatieve tests kunnen ontvangen, is dit geen veelvoorkomende situatie, aangezien de bovenstaande cijfers goed binnen het bereik vallen van wat men zou verwachten op basis van de literatuur. Men moet onthouden dat sommige honden pruritische aandoeningen hebben die lijken op atopische dermatitis (AD) en niet-allergisch zijn, terwijl anderen AD hebben met een laesiemechanisme dat waarschijnlijk geen IgE omvat. In feite vertegenwoordigde de zogenaamde "atopie-achtige dermatitis" ongeveer 15% van de honden met een laesiedistributie en pruritus die typerend is voor AD, maar negatieve intradermale en serologische tests in een recente studie (Botoni, Vet Dermatol 2019).

Waarom is er zoveel variatie?

Het antwoord is eenvoudig: deze verschillen zijn te wijten aan variabele blootstelling aan seizoensgebonden pollen. Laten we eens kijken naar de VS, waar we gegevens van de PAX hebben sinds januari 2023. In de winter was het seropositiviteitspercentage voor ten minste één soort pollen ongeveer 40%. Dit percentage varieerde tussen 48 en 64% in de lente, en in de zomer klom het tot 86% in augustus. Op dezelfde manier was er een gestage toename van het aantal allergenen dat in de immunotherapie kon worden opgenomen: ongeveer 4 in de winter, 5 in de lente en 10 in augustus.

In Europa hadden we identieke schommelingen in positieve reacties op pollenallergenen. Bijvoorbeeld, in een Nederlands laboratorium was het positiviteitspercentage voor Fag s 1, het PR-10-allergeen van Fagus sylvatica (gewone beuk), 57% in maart, 45% in april en daalde daarna tot ongeveer 10-15%. In tegenstelling tot, en vanwege een latere bloeitijd, was de piek van sensibilisatie voor Fag s 1 in het VK in mei en daalde die langzaam daarna. Op dezelfde manier en zoals verwacht, was de sensibilisatie voor graspollen het hoogst in juli in het Nederlandse en het Britse laboratorium. We moeten niet alleen aan het bloeiseizoen denken, maar meteorologische factoren hebben waarschijnlijk ook invloed op de afgifte van pollen. Een goed voorbeeld is wat werd gezien in het Spaanse PAX-laboratorium, dat voornamelijk sera van honden uit mediterrane landen en Frankrijk test. Deze zomer was het niveau van IgE-seropositiviteit voor graspollen en onkruidpollen aanzienlijk lager dan verwacht, waarschijnlijk als gevolg van de hittegolf die dat deel van Europa in juli en augustus teisterde.

Waarom werden dergelijke schommelingen niet eerder waargenomen?

Er lijkt slechts één artikel (Bjelland, Acta Vet Scand 2014) te zijn dat dergelijke variaties documenteerde. Bij Noorse honden getest met Heska's Allercept-test was het percentage seropositiviteit voor allergenen hoger in de zomer en herfst (ongeveer 87%) dan in de winter en lente (79%). Het seizoensverschil was groter voor pollenallergenen, met een lage sensibilisatiesnelheid van 39% in de winter en 50% in de zomer.

Er zijn enkele serologische tests waarbij dit seizoensverschil mogelijk niet zo duidelijk is. De belangrijkste verklaring hiervoor ligt waarschijnlijk in de mate van onvoldoende blokkering van IgE die plantallergeengebonden kruisreactieve koolhydraten herkent (dat wil zeggen, "CCD-IgE"), wat kan leiden tot fout-positieve testresultaten. Hoewel de meeste laboratoria nu CCD-IgE-blokkeringsstappen bevatten, is de PAX van Nextmune de enige die de efficiëntie van dergelijke blokkering detecteert. Als de eerste blokkering onvoldoende wordt bevonden, wordt een tweede blokkering uitgevoerd, die de reactiviteit op pollenextracten volledig kan negativeren. Bovendien bestaan bijna alle pollenallergeencomponenten in de PAX uit gerecombineerde eiwitten zonder CCD's.

Samenvattend is het positiviteitspercentage van de PAX vergelijkbaar met eerdere testresultaten, maar is er een sterke invloed van het testseizoen op het algehele sensibilisatiepercentage en dat van pollen. Bovendien elimineert een unieke CCD-blokkeringsstrategie waarschijnlijk CCD-IgE, wat zou kunnen leiden tot fout-positieve IgE-reactiviteit op pollen- en plantenvoedingsallergenen in andere serologische tests.

Wat te doen om negatieve PAX-resultaten te beperken?

Hier is onze aanbevolen strategie:

1. Dien het serum in ongeveer een maand na het begin van het seizoen waarin bekend is dat de hond opvlammingen vertoont en
2. Test wanneer de hond al in een opvlamming is, zodat de T-cellen de tijd hebben om de IgE-secretie door B-cellen te activeren.

Onthoud tot slot dat u mogelijk honden heeft met atopie-achtige dermatitis waarbij huid- en serum-sensibiliteitstests negatief zullen zijn.