Como nuestra propuesta PAX sigue ampliándose, nos complace complacerle aún más con una sección de preguntas frecuentes sobre PAX. De este modo, sacará el máximo partido a nuestro nuevo método de pruebas de alergia.

¿Qué es la alergología molecular? 

La alergología molecular es un enfoque de vanguardia para la detección de sensibilizaciones, en el que se utilizan componentes alergénicos únicos definidos para la determinación de IgE específica en lugar de los extractos de alérgenos utilizados tradicionalmente. Los componentes moleculares son proteínas purificadas o recombinantes que proporcionan un mayor nivel de estandarización que los extractos de alérgenos y permiten una identificación más precisa de las sensibilizaciones a IgE.  En la última década, las pruebas de alergología molecular para humanos se han convertido en potentes herramientas que ayudan a identificar los desencadenantes de la alergia, facilitando así la evaluación del riesgo y las decisiones terapéuticas.

¿Qué es el PAX?

El PAX (Pet Allergy Xplorer) es el primer ensayo serológico cuantitativo IgE multiplex macroarray veterinario comercial. Utilizará cartuchos con entre 250 y 300 spots que contienen tanto extractos (un tercio) como componentes moleculares (es decir, alérgenos individuales, dos tercios).

¿Cómo se seleccionaron los alérgenos para el PAX?

El PAX se deriva del ALEX2 utilizado para los seres humanos. Primero eliminamos todos los extractos y componentes (es decir, los alérgenos moleculares) que se consideraron irrelevantes para los animales de compañía (por ejemplo, los del kiwi, el camarón, el melocotón, etc...). Como el ALEX2 contiene pocos extractos, añadimos entonces los que se sabía que eran importantes para los perros, por ejemplo los del ácaro del polvo doméstico Dermatophagoides farinae y el ácaro de almacenamiento Tyrophagus putrescentiae. 

Como hay características únicas que hacen que una proteína sea un alérgeno, mantuvimos todos los componentes del ALEX2 que probablemente serían el objetivo de la IgE animal.

Por último, añadimos todos los componentes conocidos como alérgenos para animales, que estaban ausentes del ALEX2 para humanos. Después de probar más de 1.000 sueros caninos de Europa, pudimos ver que casi todos los extractos y componentes habían dado positivo en la detección de IgE específica en una proporción variable de perros, confirmando así que el enfoque para la selección de alérgenos era válido. Nextmune ajustará la naturaleza de los extractos y componentes presentes en el cartucho a lo largo del tiempo, de modo que se eliminarán los alérgenos que no sean reactivos o lo sean de forma deficiente. Por otra parte, los científicos de Nextmune trabajarán para caracterizar el "alergoma" de perros, gatos y caballos, de modo que se añadan regularmente nuevos componentes importantes a los cartuchos.

¿Hay alguna interferencia por ictericia, lipemia y hemólisis?

A una muestra de suero que contenía IgE alergeno-específica en diferentes concentraciones se le añadieron bilirrubina, triglicéridos o hemoglobina en concentraciones de 2,5, 150 y 15 mg/dL, respectivamente. Todos los valores de IgE específica se situaron dentro del 25% de los del suero sin adición, y la proporción media del suero adicionado con respecto al suero sin adición varió entre el 96 y el 100%.
Conclusión: no hay influencia relevante de la ictericia, la lipemia o la hemólisis en los resultados del PAX.

¿Qué son los CCD y dónde se encuentran?

La mayoría de los alérgenos son glicoproteínas, lo que significa que algunos aminoácidos tienen una cadena de hidratos de carbono (azúcar). Los alérgenos de las plantas (incluidos los alimentos vegetales), los venenos de insectos (abejas) y los nematodos (gusanos) tienen cadenas de carbohidratos diferentes de las de los mamíferos. Como resultado, estas cadenas pueden ser reconocidas por la IgE de humanos y animales. Desgraciadamente, como los azúcares son compartidos por los alérgenos, pueden provocar reacciones cruzadas, por lo que se denominan CCD o determinantes de carbohidratos de reacción cruzada.

¿Cómo intervienen los CCD en la alergia?

Durante una reacción alérgica, se produce IgE contra las cadenas de carbohidratos, así como contra las proteínas del alérgeno. Los estudios han confirmado que esto ocurre en el 30% de los seres humanos, perros y gatos. La IgE contra las cadenas de CCD no parece ser clínicamente relevante.

¿Por qué es importante bloquear los CCD?

El bloqueo de los CCD aumenta la especificidad de la prueba serológica. Las pruebas demuestran que también mejora la correlación con los resultados de las pruebas intradérmicas.

¿Se bloquean en PAX los determinantes de carbohidratos de reactividad cruzada (CCD)?

Cada suero animal analizado se diluye en un tampón que contiene una mezcla patentada de proteínas que contienen diferentes tipos de CCD. El PAX es también la primera prueba serológica veterinaria que ha incorporado detectores CCD en cada cartucho para verificar la eficacia del bloqueo CCD. 

¿Qué reactivo anti-IgE se utiliza en el PAX

Para la prueba canina, el PAX utiliza el anticuerpo monoclonal anti-IgE canina 5.91, que fue producido en la década de 1990 por el profesor Bruce Hammerberg en la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Estatal de Carolina del Norte. Este anticuerpo reconoce un epítopo en el segmento Ce2 del fragmento Fc de la IgE canina. El epítopo es distinto de las regiones de IgE que se unen a los receptores de IgE de alta y baja afinidad, lo que garantiza que no haya interferencias de los receptores solubles de IgE que están presentes de forma natural en los perros alérgicos. Es importante señalar que la secuencia del epítopo reconocido en la IgE canina es completamente diferente de la presente en la IgM, IgA y las cuatro subclases de IgG caninas (IgG1 a IgG4). De hecho, hemos verificado, utilizando tanto ELISA estándar como el PAX, que el anticuerpo 5.91 no se une a la IgG canina.
Se está trabajando para identificar el mejor anticuerpo contra IgE felina y equina para su inclusión en el PAX.
Conclusión: el anticuerpo monoclonal anti-IgE 5.91 es exclusivamente específico para la IgE canina. Se utilizará un anticuerpo diferente para gatos y caballos.

¿Cuál es la precisión del ensayo?

La precisión se determinó en dos condiciones diferentes:
Para la variación entre lotes de cartuchos, se compararon dos lotes diferentes utilizando 54 combinaciones de alérgeno/muestra que cubrían 44 alérgenos. Para los valores de IgE específica inferiores a 400 ng/mL, el coeficiente de variación intraensayo fue del 3,0% y el coeficiente interensayo fue del 7,1%. Para los valores superiores a 400 ng/mL, estos CV% fueron del 2,0 y el 5,2%, respectivamente.
Para determinar la repetibilidad, se analizaron tres muestras de suero canino por duplicado en cinco corridas diferentes. Como en el caso anterior, para los valores más bajos de IgE, los CV% intra e interensayo fueron del 6,2 y 8,2%, respectivamente; los de los valores más altos fueron del 2,7 y 7,0%, respectivamente.
Conclusión: La precisión del PAX es excelente y los resultados son muy reproducibles.

¿Por qué existen más resultados negativos cuando envío sueros caninos para ser evaluados con el PAX en comparación con otras tecnologías más antiguas?

Para responder mejor a esta pregunta, echemos un vistazo a los resultados del PAX recopilados hasta ahora en 2023 de más de 25,000 perros.

En Europa (11,196 sueros), los porcentajes de perros con al menos una prueba positiva variaron según el laboratorio de pruebas (España, Países Bajos y el Reino Unido) y el mes de prueba, oscilando entre 83% (España, abril) y 96% (Reino Unido, junio). Si solo consideráramos el porcentaje de perros que podrían ser candidatos para la inmunoterapia (es decir, excluyendo alérgenos alimentarios, venenos de insectos y alérgenos de la saliva de pulgas Cte f 1), los porcentajes variarían entre 51% (Reino Unido, abril) y 88% (Reino Unido, junio; Países Bajos, abril).

En los Estados Unidos, el porcentaje entre los 14,243 perros con al menos una IgE específica detectable con el PAX se ha mantenido bastante estable durante la mayor parte del invierno y la primavera (84-87%), para aumentar en julio (88%) y agosto (95%). De entre estos, el porcentaje de perros potencialmente tratables con inmunoterapia varió desde un mínimo del 70% en enero, aumentando cada mes hasta alcanzar el 91% en agosto.

Aunque algunos veterinarios ocasionalmente pueden recibir una serie de pruebas negativas, esta no es una situación generalizada, ya que los números anteriores están dentro del rango de lo que se esperaría según la literatura. Es importante recordar que algunos perros tienen condiciones pruríticas que se asemejan a la dermatitis atópica (AD) pero que no son alérgicas, mientras que otros tienen AD con un mecanismo de lesión que probablemente no involucra a la IgE. De hecho, la llamada "dermatitis de tipo atópico" representó aproximadamente el 15% de los perros con una distribución de lesiones y prurito típicos de la AD pero con pruebas intradérmicas y serológicas negativas en un estudio reciente (Botoni, Vet Dermatol 2019).

¿Por qué existe tal variación?

La respuesta es simple: estas diferencias se deben a la exposición variable a polen estacional. Veamos los datos del PAX para los Estados Unidos, para los cuales tenemos información desde enero de 2023. En invierno, la tasa de seropositividad a al menos un polen fue de alrededor del 40%. Esta tasa varió entre el 48% y el 64% en primavera, y en verano, se elevó al 86% en agosto. De manera similar, hubo un aumento constante en el número de alérgenos que podrían incluirse en la inmunoterapia: alrededor de 4 en invierno, 5 en primavera y 10 en agosto.

En Europa, hemos experimentado cambios similares en la positividad a alérgenos de polen. Por ejemplo, en un laboratorio neerlandés, la tasa de positividad para Fag s 1, el alérgeno PR-10 del haya común Fagus sylvatica, fue del 57% en marzo, el 45% en abril, y disminuyó a alrededor del 10-15% después de eso. En contraste, y debido a un momento de polinización posterior, el pico de sensibilización a Fag s 1 en el Reino Unido fue en mayo y luego disminuyó lentamente. De manera similar y como era de esperar, la sensibilización a los pólenes de gramíneas fue mayor en julio en los laboratorios neerlandeses y del Reino Unido. No solo debemos considerar la temporada de polinización, sino que los factores meteorológicos también pueden influir en la liberación de polen. Un gran ejemplo es lo que se observó en el laboratorio del PAX español, que realiza pruebas principalmente en sueros de perros que viven en países del Mediterráneo y Francia. Este verano, el nivel de seropositividad de IgE a los pólenes de césped y malezas fue notablemente menor de lo esperado, probablemente debido a la ola de calor que afectó a esa parte de Europa en julio y agosto.

¿Por qué no se observaron tales fluctuaciones antes?

Parece que solo hay un artículo (Bjelland, Acta Vet Scand 2014) que documentó tal variación. En perros noruegos evaluados con la prueba Allercept de Heska, la tasa de seropositividad a alérgenos fue mayor en verano y otoño (alrededor del 87%) que en invierno y primavera (79%). La diferencia estacional fue mayor para los alérgenos de polen, con una tasa de sensibilización baja del 39% en invierno y del 50% en verano.

Existen algunas pruebas serológicas en las que esta diferencia estacional puede no ser aparente. La explicación principal de esto radica en el bloqueo insuficiente de la IgE que reconoce carbohidratos cruzados de alérgenos vegetales (es decir, "CCD-IgE"), lo que lleva a resultados falsos positivos en la prueba. Si bien la mayoría de los laboratorios ahora incluyen pasos de bloqueo de CCD-IgE, el PAX de Nextmune es el único que detecta la eficiencia de dicho bloqueo. Si se encuentra que el primer bloqueo es insuficiente, se realiza un segundo bloqueo, lo que podría negativizar por completo la reactividad a los extractos de polen. Además, casi todos los componentes de alérgenos de polen en el PAX son proteínas recombinantes que carecen de CCDs.

En resumen, la tasa de positividad del PAX es similar a la de otros resultados de pruebas informados anteriormente, pero existe una fuerte influencia de la temporada de pruebas en la tasa de sensibilización general y la de los pólenes. Además, una estrategia de bloqueo única de CCD probablemente elimina la CCD-IgE, lo que podría dar como resultado una reactividad falsa positiva a pólenes y alérgenos alimentarios en otras pruebas serológicas.

¿Qué hacer para limitar los resultados negativos del PAX?

Aquí está nuestra estrategia recomendada:

1. Envíe el suero aproximadamente un mes después del inicio de la temporada en la que se sabe que el perro presenta brotes.
2. Realice la prueba cuando el perro esté en medio de un brote para que las células T tengan tiempo de activar la secreción de IgE por parte de las células B.

Finalmente, recuerde que es posible que tenga perros con dermatitis de tipo atópico en los que las pruebas de sensibilización en la piel y en suero sean negativas.